유전자 기반연구

이 연구는 핵산 검사(NAT) 분야에서 주목받는 CRISPR 진단법의 민감도를 향상시키고 오염 위험을 줄이는 새로운 기술에 관한 것입니다.

핵심 내용:

1. CRISPR 진단법의 장점: CRISPR 기반 진단 방법은 특정 핵산 서열을 매우 정확하게 찾아내는 능력(높은 특이도), 적은 양의 목표물도 검출하는 능력(높은 민감도), 그리고 비교적 간단한 과정(간편성) 때문에 핵산 검사 분야에서 큰 관심을 받고 있습니다.

2. 기존 문제점: 민감도를 더욱 높이고 검사 과정 중 용기 뚜껑을 여닫으면서 발생할 수 있는 시료 오염 위험을 없애기 위해, 핵산 증폭 방법인 RPA(재조합 효소 중합효소 증폭)와 CRISPR 시스템을 한 용기 안에서 동시에 반응시키는 '원팟(one-pot)' 방식이 사용됩니다. 하지만 문제가 있습니다. CRISPR 시스템(특히 Cas 효소)이 목표 핵산을 자르는 활성 때문에, 함께 넣어준 RPA 반응의 효율을 떨어뜨려 전체적인 검출 민감도를 제한하게 됩니다. 즉, 증폭이 충분히 되기 전에 CRISPR 효소가 작동해 증폭 과정을 방해할 수 있습니다.

3. 제안된 해결책: 광변조(Photomodulation) 시스템: 이 연구에서는 이러한 문제를 해결하기 위해 '광변조', 즉 빛으로 효소 활성을 조절하는 방법을 도입한 새로운 원팟 RPA/CRISPR-Cas12a 시스템을 제안합니다.

   • 작동 원리:
     • Cas12a 효소의 활성을 일시적으로 막는 '억제 앱타머(inhibitory aptamer)'를 사용합니다. 이 앱타머에는 특별히 '광분해성 링커(photocleavable linker, PC linker)'라는, 자외선(UV) 빛에 의해 끊어지는 연결 부위가 붙어 있습니다.
     • 반응 초기에는 이 앱타머가 Cas12a 단백질에 결합하여 그 활성을 억제합니다. 따라서 RPA 반응이 진행되는 동안 Cas12a는 RPA 구성 요소들을 분해하거나 증폭 과정을 방해하지 않고, 핵산 증폭이 효율적으로 일어날 수 있습니다.
     • RPA를 이용한 핵산 증폭이 충분히 완료된 후, 짧은 시간 동안 자외선(UV)을 쬐어줍니다.
     • UV 빛은 앱타머에 있는 광분해성 링커를 정확히 끊어냅니다.
     • 링커가 끊어지면 앱타머가 Cas12a로부터 떨어져 나가고, 비로소 Cas12a 효소가 활성을 되찾게 됩니다.
     • 활성화된 Cas12a는 증폭된 목표 핵산을 인식하고 절단하며, 이 과정에서 형광 신호가 발생하여 목표 핵산의 존재 유무를 검출할 수 있게 됩니다.

4. 장점 및 결과:

   • 이 '광변조 원팟 RPA/CRISPR-Cas12a' 접근법은 뚜껑을 열 필요가 없어 오염 위험을 효과적으로 제거합니다.
   • CRISPR 고유의 높은 특이도를 그대로 유지합니다.
   • RPA 증폭 과정과 CRISPR 검출 과정의 간섭 문제를 해결하여 민감도 저하 요인을 완화합니다.
   • 실험 결과, 이 방법을 사용하여 **아프리카돼지열병 바이러스(African swine fever virus)**의 p72 유전자를 **마이크로리터(µL)당 2.5 카피 (총 50 카피)**라는 매우 낮은 농도에서도 성공적으로 검출하여 높은 민감도를 입증했습니다.

5. 결론 및 전망: 이 연구에서 개발된 효율적인 원팟 분석법은 높은 민감도, 비용 효율성, 간편성, 안정적인 설계를 갖추고 있습니다. 따라서 실험실 환경이 아닌 **현장 진단(field diagnostics)**에서도 활용 가능성이 매우 높은 유망한 핵산 검사 기술로 평가됩니다.