유전자 기반연구

Haemonchus contortus (H. contortus) 검출을 위한 RPA-CRISPR/Cas12a 기술 상세 설명

이 연구는 Haemonchus contortus (H. contortus) 라는 양에게 심각한 질병(haemonchosis)을 일으키는 기생충을 신속하고 정확하게 검출하는 새로운 방법을 개발한 것에 대한 내용입니다. H. contortus는 양의 혈액을 빨아먹고 살며, 전 세계적으로 양 축산업에 막대한 경제적 손실을 초래합니다. 따라서 이 기생충을 빠르고 정확하게 진단하는 것은 매우 중요합니다.

개발된 기술 (RPA-CRISPR/Cas12a):

이 연구에서는 RPA (Recombinase Polymerase Amplification) 와 CRISPR/Cas12a 기술을 결합하여 H. contortus를 검출하는 "원-팟(one-pot)" 방식을 개발했습니다. "원-팟" 방식이란, 여러 단계의 실험 과정을 하나의 튜브 안에서 진행하여 간편하고 빠르게 결과를 얻을 수 있는 방식을 의미합니다.

• RPA (Recombinase Polymerase Amplification):

  • H. contortus의 ITS2 유전자 (특정 유전 부위)를 목표로 하여, 이 유전자가 존재하면 DNA를 빠르게 증폭시키는 기술입니다.
  • 기존의 PCR 기술과 유사하지만, 훨씬 낮은 온도(상온)에서 반응이 가능하여 별도의 온도 조절 장치가 필요 없습니다.

• CRISPR/Cas12a:

  • 증폭된 H. contortus의 DNA를 특이적으로 인식하여 절단하는 효소 시스템입니다.
  • Cas12a는 목표 DNA를 절단할 때, 주변의 다른 DNA(형광 표지된 DNA)도 함께 절단하는 부수적인 활성(collateral activity)을 가지고 있습니다.
  • 이 부수적인 활성을 이용하여, H. contortus DNA가 존재하면 형광 신호가 감소하거나 (UV 또는 파란색 빛 아래에서 관찰) 또는 측면 흐름 스트립(LFS, Lateral Flow Strip)에 밴드가 나타나도록 설계했습니다.

검출 과정 (1시간 이내):

1. DNA 추출: 양의 분변 샘플에서 DNA를 추출합니다.
2. RPA 반응: 추출된 DNA를 RPA 시약과 혼합하여 H. contortus의 ITS2 유전자를 증폭시킵니다.
3. CRISPR/Cas12a 반응: 증폭된 DNA가 있으면 Cas12a가 활성화되어 형광 신호를 감소시키거나 LFS에 밴드를 생성합니다.
4. 결과 확인: 형광 신호의 변화를 UV 또는 파란색 빛 아래에서 관찰하거나, LFS의 밴드 유무를 확인하여 H. contortus 감염 여부를 판단합니다.

기술의 장점:

• 높은 특이성: H. contortus의 ITS2 유전자를 특이적으로 검출하므로, 다른 9가지 흔한 양 병원체와 교차 반응이 없습니다. 즉, H. contortus만 정확하게 검출합니다.
• 높은 민감도: 형광 검출 시 0.1 copies/μL, LFS 검출 시 100 copies/μL의 낮은 농도까지 검출 가능합니다. 매우 적은 양의 기생충도 검출할 수 있습니다.
• 간편하고 신속함: 전체 검사 과정이 1시간 이내에 완료됩니다.
• 휴대성 및 가시성: 별도의 복잡한 장비 없이, UV 램프나 파란색 빛, 또는 LFS를 이용하여 결과를 육안으로 확인할 수 있습니다.
• 현장 적용 가능성 (Point-of-Care Testing, POCT): 장비 의존성이 낮고 휴대가 가능하여, 자원이 제한된 농촌 지역이나 현장에서 바로 검사 결과를 확인할 수 있습니다.

실험 결과:

89개의 양 분변 샘플을 대상으로 검증한 결과, 개발된 RPA-CRISPR/Cas12a 방법은 46.07%의 양성률을 보였으며, 이는 기존의 정확한 검사 방법인 quantitative PCR (qPCR) 결과와 완전히 일치했습니다.

결론:

이 연구에서 개발된 RPA-CRISPR/Cas12a 기반 H. contortus 검출 방법은 높은 특이성, 민감도, 간편성, 휴대성 등의 장점을 가지며, 현장에서 신속하고 정확하게 H. contortus 감염 여부를 진단할 수 있는 유용한 도구가 될 수 있습니다. 특히, 자원이 부족한 지역에서 양 축산업의 생산성 향상에 기여할 수 있을 것으로 기대됩니다.